作者： 武汉兴物源生物科技有限公司 程逍妹 华中农业大学 胡明 陈昌福 1 实验方法 1.1 试验地点及泥鳅的饲养条件 本试验在江苏省射阳县黄沙港镇盐城裕达水产养殖公司进行。将供试泥鳅放置于室内圆形玻璃钢水族箱中进行饲养。用于本试验的泥鳅全部来自裕达水产养殖公司的养殖池塘。在设置于室内的每个盛水500.0升的水族箱中，饲养平均体长10.4 cm的400尾以上的泥鳅。试验期间水温变化在（25±4）℃，光照为人工光照和自然光照。每天上午9:00和下午6:00各投1次盐城裕达饲料有限公司生产的泥鳅专用饲料，供试泥鳅被预备试验饲养7d，待供试泥鳅完全适应室内饲养环境后，选择身体无外伤、健康活泼的泥鳅进行如下饲养效果的试验。 1.2 供试蝇蛆浆 用于本研究的蝇蛆浆，由武汉兴物源生物科技有限公司提供。 1.3 试验设计 选择没有外伤而游动正常的泥鳅，随机分别投放于水族箱中，每个水族箱内放养400尾泥鳅。每组免疫增强剂采用6个水族箱，每个剂量设定2个重复，在共18个水族箱内完成3组泥鳅的饲养试验。在泥鳅的饲料中添加蝇蛆粉的剂量设定为0 kg/T（蝇蛆对照组，“T”表示吨，下同）、50 kg/T（蝇蛆I组）和100kg/T（蝇蛆Ⅱ组）。 饲料中蝇蛆浆的添加方法是，将盐城裕达饲料有限公司生产的泥鳅专用饲料与一定比例的蝇蛆浆均匀混合后，置于阴凉通风处凉干。 按照预备饲料饲养时的饲料投喂程序，投饵量以使供试泥鳅达到饱足并有少量剩余为准。对照组所用饲料中除没有添加蝇蛆粉等物质之外，饲料中其它营养成分均没有改变。试验程序是连续投喂40 d。由于泥鳅外观上难以区分雌雄。因此，在本研究中不区分试验动物的性别。 1.4 吞噬原的制备 将金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）接种在液体肉汤培养基中，37℃下培养48 h后，离心集菌，在菌液中加入浓度为0.5%的福尔马林，37℃下灭活24h，用灭菌生理盐水清洗3次，并将其浓度调整至1.0×108 cells/mL，即为福尔马林灭活的S.aureus菌体（formalin killed S.aureus，F-SA），用作检测白细胞吞噬活性的吞噬菌体。 1.5 采血 于投喂添加蝇蛆粉饲料结束后的第2 d，从各试验个对照组中分别随机捞取30尾泥鳅（每个平行试验水簇箱中各捞取15尾，以下采用相同的平均获取样品的方法），从泥鳅的尾主动脉采血（图8、图9）。将每5尾泥鳅的血液混合为一个样品后，将血液分为2份，其中1份以肝素抗凝，制备成抗凝血，供检测白细胞吞噬活性；将另一份血液首先在室温下静置1 h待其凝固，再置于4℃的冰箱保持4 h后，于4℃条件下以4000 r/min离心10 min，收集上层血清，保存在4℃冰箱中，备用。 对采血后的泥鳅进行解剖，观察试验与对照组泥鳅脏器形态与颜色等方面的异同。判断不多试验组与对照组是否对鱼体脏器产生影响。 1.6 溶菌酶活性的测定 用0.067mol/L的磷酸缓冲液 （PBS，pH 6.4）将溶壁微球菌（Micrococcus lysoleikticus）配制成0.2mg/mL 的菌悬液。每个样品取3.0 mL菌悬液，吸取血清40.0 μL加入到菌悬液中，混匀后，立刻在540 nm下测定A。值。然后在28℃水浴中温育30 min，取出后置于4℃冰浴中终止反应，再测定A值。按公式计算溶菌酶的活性：U=（A。- A）/ A。 1.7 白细胞吞噬活性的测定 在0.2 mL抗凝血中加入0.1 mL F-SA，摇匀，在28℃的恒温水浴锅中孵育45 min，每隔10 min摇动1次。用吸管吸取血细胞涂片，每个样品涂5张，用甲醇固定10 min，Giemsa染色液染1 h，水洗风干后，镜检，并依下式计算白细胞吞噬百分比（phagocytic percentage， PP）和吞噬指数（phagocytic index，PI）。 吞噬百分比（PP）= —————————— ×100 100 细胞内总菌数 吞噬指数（PI ）= ———————— 参与吞噬的细胞数 1.8 血清中补体C3、C4含量的测定 根据待测样品（含校准液）将反应剂与抗体液按每1.0mL反应剂加入50.0μL 抗体液的比例配制，配好的工作液当日用完。于干净离心管中按照试剂与样品比例为200︰1量加入5.0μL 蒸馏水和1000.0μL试剂，作为空白管，同时按照同样比例加入5.0μL 的校准液或样品，混匀，37℃水浴10 min，用透射比浊法在752型紫外分光光度计340 nm波长处读取测定管和标准管的光密度值（A），空白管进行仪器调零，标准管绘制标准曲线，以计算补体 C3 和 C4 的含量。 1.9 血清中谷丙转氨酶活性的测定 采用谷丙转氨酶试剂盒（上海科欣生物技术研究所产品）测定。 1.10 血清中总蛋白含量的测定 采用血清总蛋白试剂盒（上海科欣生物技术研究所产品）测定。 1.11 攻毒试验 对于供试和对照泥鳅的攻毒方式采取注射的方式进行，取人工培养的嗜水气单胞菌，制备成107cfu/mL的菌液浓度后，对每尾供试泥鳅的腹腔注射0.2mL后（图10），各实验组均注射300尾，3个对照组各注射100为，合计300尾。放回水族箱继续饲养观察患病与死亡状况。 将供试泥鳅放回水族箱中继续饲养时，采取充气维持水体中有足够的氧气。每天投喂2次未添加任何免疫增强剂的颗粒饲料，并记录鱼体活动状态和死亡情况。最后按照如下公式计算试验鱼的相对免疫保护率（RPS）。相对免疫保护率=[1－（免疫组死亡率/对照组死亡率）]×100% 1.12 解剖观察及脏器测量 通过对每组采血后的各20尾泥鳅进行解剖，肉眼观察试验与对照组泥鳅脏器的异同，并对分离的器官和组织分别称重，用以比较试验与对照组泥鳅的机体指标（简称“体指”）异同。 1.13 诱食效果的判定 在预定连续投喂的40 d中，每天统计供试泥鳅的摄食量，将对照组泥鳅的饵料系数作为1。评价蝇蛆浆在饲料中的不同添加量对泥鳅摄食量的影响，判断蝇蛆浆是否具有诱导泥鳅摄食的效果。 1.14 促生长效果的判定 在预定连续投喂40 d结束后，将尚没有用于采样和攻毒的全部的泥鳅捞起来称重，根据统计泥鳅的摄食量，计算饵料系数，将对照水族箱中饲养的泥鳅的饵料系数作为1。评价蝇蛆粉在饲料中的不同添加量促进泥鳅的摄食效果，判断蝇蛆粉是否具有促进摄食的效果。 2 结果 2.1 蝇蛆浆等对泥鳅生长速度的影响 试验期间对照和各试验组泥鳅的增重量测定结果如表1所示。首先，投喂蝇蛆浆的试验组泥鳅的增重量均显著地高于对照组的增重量（t测验，P<0.05），而蝇蛆浆的不同添加剂量组之间增重量并没有出现显著的差异（t测验，P>0.05）。 表1 对照和试验泥鳅的增重量1）  1）30尾供试鱼的平均值； * 表示与未添加蝇蛆浆等的对照组之间存在显著差异。 2.2 蝇蛆浆等对泥鳅的诱食与促生长效果 根据在试验期间（只计算40 d内的投喂时间）对各对照和试验组泥鳅的增重量，以及40 d的总投喂饲料数量，计算出来的饵料系数结果如表2所示。首先，投喂蝇蛆浆试验组泥鳅的饵料系数均显著地低于对照组的饵料系数（t测验，P<0.05），而蝇蛆浆的不同添加剂量组之间虽然饵料系数有一点差异，但是并没有出现显著的差异（t测验，P>0.05）。 将对照组饵料系数作为1进行比较，所有试验组的饵料系数均低于1，说明蝇蛆浆等对泥鳅的诱食和促进生长的作用是比较明显的。 表2 对照和试验泥鳅的饵料系数1）  1）将全部试验泥鳅一起称重后计算的饵料系数； * 表示与未添加蝇蛆浆等的对照组之间存在显著差异。 2.3 溶菌酶活性和白细胞吞噬活性的变化 投喂添加蝇蛆浆的饲料后，对照和试验组泥鳅的血清溶菌酶活性和白细胞吞噬活性的 表3 对照和试验组泥鳅血清中溶菌酶活性和白细胞吞活性  *表示与未添加昆虫蛋白提取物等的对照组之间存在显著差异。 ** 表示与未添加昆虫蛋白提取物等的对照组之间存在极显著差异。 测定结果如表3所示。如表3所示，投喂蝇蛆浆试验组泥鳅血清中的溶菌酶活性显著高于未添加任何物质的对照组（t测验，P<0.05）。白细胞吞噬活性的测定结果表明，投喂蝇蛆浆的试验组试验组血液中白细胞的PP和PI均极显著地高于对照组（t测验，P<0.01），而投喂投喂蝇蛆浆的试验组之间，泥鳅血液中白细胞的吞噬活性未出现显著性差异（t测验，P>0.05）。 2.4 泥鳅血清中补体C3 、C4、总蛋白和谷丙转氨酶活性活性的变化 供试泥鳅的血清中补体C3、C4、总蛋白含量和谷丙转氨酶活性测定结果如表4 所示。 表4 对照与试验组泥鳅血清总蛋白和谷丙转氨酶活性1）  从表4所示结果可以看出，投喂蝇蛆浆的试验组泥鳅血清中补体C3、C4的活性均显著高于未添加任何物质的对照组（t测验，P<0.05）。但是，试验组鱼体的血清中总蛋白含量和谷丙转氨酶活性含量有所提高，而对照与试验组泥鳅血清中总蛋白含量和谷丙转氨酶活性并未出现显著性差别（t测验，P>0.05）。值得注意的是，对谷丙转氨酶活性的测定结果表明，在饲料中添加蝇蛆浆等可以降低鱼体血清中谷丙转氨酶的活性，但是，试验与对照组泥鳅之间未出现显著性差异（t测验，P>0.05）。 此外，对于采血后泥鳅解剖观察的结果证明，试验组与对照组泥鳅的脏器均未出现明显的区别。 2.5 攻毒后的存活率 采用注射嗜水气单胞菌的方法，对试验和对照泥鳅经活菌攻毒后，各组的死亡情况如表 表5 活菌攻毒后泥鳅的死亡率和免疫保护率  *从3个对照组中各取100尾泥鳅进行的攻毒试验。 5所示。从表5 可以看出，投喂蝇蛆浆的试验组泥鳅对接种的嗜水气单胞菌具有一定的免疫保护力（RPS），而在饲料中添加蝇蛆浆的试验组泥鳅死亡率明显的低于对照组。但是，各个添加蝇蛆浆的试验组泥鳅之间的RPS，则未出现明显的不同，二是具有大致相同的RPS。 3、讨论 在本研究中，添加蝇蛆浆的试验组泥鳅的生长状况显著的优于对照组，但是不同添加量的试验组之间却则没有出现显著差别，这种结果表明在饲料中添加蝇蛆浆有一定的促进泥鳅生长的作用，而且当其添加量在50 kg/T ~100 kg/T之间，其饲养效果没有出现显著性差异。 对泥鳅投喂蝇蛆浆后，供试泥鳅的白细胞吞噬活性增强、血清中溶菌酶活性和补体C3、C4成分活性上升和经活菌攻毒后的死亡率下降，说明投喂蝇蛆浆能提高泥鳅的非特异性和特异性免疫应答水平。即蝇蛆浆对于泥鳅的免疫系统具有一定的激活作用。 通过计算试验组与对照组的饵料系数，认为蝇蛆浆对泥鳅具有一定的诱食和促进生长的效果。但是，根据江苏省盐城裕达水产养殖公司2015年在池塘中养殖的泥鳅计算的饵料系数仅为1.53左右，说明我们在实验室饲养泥鳅，无论试验鱼对照组，饵料系数均是偏高的。其原因尚值得分析。(参考文献略) |
