| 出处：水生动物健康评估公众号 作者：龙梦 水产养殖网 2020-04-06 22:46:00 | 
杀鲑气单胞菌是海水和淡水鱼疖疮病病原菌，通过皮肤、肠道或鳃侵入鱼体，扩散并定殖于头肾，肝脏，脾脏和大脑。杀鲑气单胞菌的毒力与其在巨噬细胞等吞噬细胞中的复制能力有关，且该菌可以侵袭非吞噬上皮细胞并在其中复制，但杀鲑气单胞菌在鱼红细胞中的侵袭和复制尚不清楚。与哺乳动物的红细胞不同，鱼类红细胞是有核细胞，并且没有关于这些硬骨鱼红细胞内细菌感染的报道。土拉弗朗西斯菌、猪支原体、鸡支原体和巴尔通体属被报道可侵入哺乳动物的红细胞，血原菌和犬嗜血支原体在鱼的红细胞外部定植或附着但并未侵入红细胞。红细胞胞内感染可以帮助细菌逃避宿主防御机制，并轻松获得铁等必需营养进行增殖。下面介绍的这篇文章运用体内和体外试验评估了杀鲑气单胞菌是否具有感染大西洋鲑红细胞并在其中存活的能力，引用信息如下：
结果
1、大西洋鲑原代红细胞感染杀鲑气单胞菌后的生存力和庆大霉素排除分析
图1. 杀鲑气单胞菌感染鲑鱼原代红细胞。（a）15oC下，感染不同剂量的杀鲑气单胞菌后48h内鲑鱼原代红细胞（RBC）的存活率，RBC感染不同的MOI（红细胞：细菌）；（b）鲑鱼原代红细胞的庆大霉素排除分析：15oC下，相对于初始接种量，感染后1小时（附着）和感染后2小时和3小时（侵袭）杀鲑气单胞菌的百分比。
为了确定红细胞感染杀鲑气单胞菌过程中的生存力，用不同的MOI（红细胞：细菌）感染鲑鱼红细胞（RBC），在感染后12和48小时确定生存力。鲑鱼RBC显示出对杀鲑气单胞菌感染的高抗性，MOI在1：100以内的细胞存活率超过80％（图1a），MOI 为10：1和1：100之间未检测到显着差异，但MOI在1：1,000时检测到显着差异，在该处理组中，感染后48小时RBC活力下降至20％以下（图1a）。这些结果表明，杀鲑气单胞菌在生理相关MOI（1：1）内不会杀死RBC。
使用庆大霉素排除分析，我们评估了杀鲑气单胞菌是否具有感染鲑鱼原代红细胞并在其中存活的能力。首先，我们评估了杀鲑气单胞菌在12孔板中附着RBC的能力，与初始接种细菌（1.66 x 107 CFU）相比，附着在RBC上的杀鲑气单胞菌平均百分比为42.27±11％（7.8 x 106 CFU）（图1b）。感染后1小时后，用庆大霉素处理以排除细胞外杀鲑气单胞菌，感染后2小时和3小时杀鲑气单胞菌百分比为0.047±0.018％（5.90 x 103 CFU）和0.032±0.031％（2.10 x 103 CFU）（与初始接种细菌相比）（图1b），感染后2小时和3小时之间没有显着差异。
2、流式细胞仪（荧光激活细胞分选）
图2. 荧光激活细胞分选术（FACS）评估杀鲑气单胞菌感染鲑鱼原代红细胞（RBC）。（a）对照，未感染红细胞；（b）对照，红细胞感染未标记的杀鲑气单胞菌2小时，庆大霉素处理1小时；（c）红细胞感染DTAF标记的杀鲑气单胞菌2小时，庆大霉素处理1小时；（d）对照，无标记杀鲑气单胞菌；（e）对照，DTAF标记的杀鲑气单胞菌。所有测定均在15oC进行。
图3. 荧光激活细胞分选术（FACS）评估鲑鱼原代红细胞（RBC）的吞噬作用。（a）红细胞接种未标记的灭活杀鲑气单胞菌；（b）红细胞接种DTAF标记的灭活杀鲑气单胞菌；（c）红细胞接种FITC标记的乳胶珠；（d）对照，未标记的灭活杀鲑气单胞菌；（e）对照，DTAF标记的灭活鲑鱼气单胞菌；（f）FITC标记的乳胶珠。测定在15oC下进行。
我们使用流式细胞仪验证了庆大霉素排除分析结果。三个重复试验的流式细胞仪数据显示，感染后2小时（庆大霉素处理后1小时）DTAF标记的杀鲑气单胞菌感染红细胞的平均感染百分比为为0.192±0,074（图2）。此外，我们发现福尔马林灭活的DTAF标记杀鲑气单胞菌和FITC标记的乳胶珠被鲑鱼原代RBC吞噬，平均百分比分别为0.140±0.064和0.043±0.025（图3）。
3、共聚焦显微镜检查感染的红细胞
图4. 共聚焦显微镜评估杀鲑气单胞菌感染鲑鱼原代红细胞。（a）DTAF标记的杀鲑气单胞菌（1000x）;（b）红细胞用DAPI染色，并用DTAF标记的杀鲑气单胞菌感染2小时和庆大霉素处理1小时（600x）；（c）红细胞用DAPI染色，并用DTAF标记的杀鲑气单胞菌感染2小时和庆大霉素处理1小时（600x；暗视野）；（d）红细胞用DAPI染色，并用DTAF标记的杀鲑气单胞菌感染2小时和庆大霉素处理1小时的3D成像。分析在15oC下进行。
为了确定鲑鱼原代RBC中细胞内细菌的存在，用DTAF标记的杀鲑气单胞菌感染RBC（图4a）。共聚焦显微镜显示杀鲑气单胞菌侵入鲑鱼原代红细胞（图4a），杀鲑气单胞菌位于红细胞的细胞质中（图4b-d），没有观察到RBC的裂解。3D成像证实杀鲑气单胞菌位于鲑鱼原代RBC的细胞内（图4d）。
4、杀鲑气单胞菌感染大西洋鲑和红细胞定殖
图5. 鲑鱼感染杀鲑气单胞菌后的存活率和血液细菌定量。（a）鲑鱼10oC下腹膜内感染杀鲑气单胞菌（104 CFU 100 / g）后的存活率；（b）鲑鱼感染杀鲑气单胞菌第5天和第10天血液中活杀鲑气单胞菌的检测。
图6. 杀鲑气单胞菌体内感染鲑鱼红细胞的检测。外周血涂片检查。（a）未感染杀鲑气单胞菌的鲑鱼红细胞；（b）杀鲑气单胞菌感染第5天的鲑鱼红细胞（1000x）;（c）鲑鱼红细胞感染杀鲑气单胞菌的细胞内定位放大。将所有细胞风干固定2小时后用Giemsa染色。
为了确定体外结果是否具有生物学意义，用鲑鱼幼鱼进行感染实验，并在外周血红细胞中评估了红细胞内细菌的存在。鲑鱼腹腔注射感染杀鲑气单胞菌后5-8天表现出疖疮症状，首次死亡发生在8 dpi，死亡持续到13 dpi。30 dpi时的平均生存率为8.6％（图5a）。在5和10 dpi时观察到细菌血症（图5b），并观察到红细胞内杀鲑气单胞菌（图6）。
结论
本项研究发现大西洋鲑红细胞具有吞噬能力（图1-3），但低于原代巨噬细胞。尽管鲑鱼红细胞具有吞噬细菌和颗粒的能力（图2-4），但杀鲑气单胞菌在感染动物的红细胞和血液中仍处于可培养状态（图1b）。巧合的是，所有出现菌血症的感染鱼在接下来的3天内死亡（图5a），在所有样品鱼中均观察到红细胞中存在杀鲑气单胞菌（图6b，c），并伴有感染过程。这些结果描述了杀鲑气单胞菌的新型感染形式。
我们的数据表明，杀鲑气单胞菌不会杀死鲑鱼原代红细胞（图1a），但会侵入红细胞内（图1‒6）。这些结果说明杀鲑气单胞菌可能会利用红细胞逃避宿主防御机制（例如补体溶解，循环吞噬细胞，抗体或抗菌肽），并获得由宿主螯合的营养物质（如铁）。而且，杀鲑气单胞菌的红细胞内相对有益于细菌在整个宿主组织中的增殖。 |
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